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  本发明属于植物发酵技术领域，具体涉及一种洋甘菊发酵液抑制菌类凝胶及其制备方法。

  女性具有特殊的生理结构和解剖结构，这引起了女性妇科病的多发性，最重要的包含外阴疾病、疾病、子宫疾病、输卵管疾病、卵巢疾病等。许多人缺乏对妇科疾病的认知和身体健康的关注，加之某些不良的生活小习惯，使生理健康逐渐下降，导致一些女性疾病缠身，且久治不愈，给正常的生活、工作带来极大的不便。

  女性生殖道菌群失调是妇科疾病的根源。生理情况下，的生态平衡主要由乳杆菌、雌激素及ph维持着。雌激素使上皮增生变厚，并增加细胞内糖原含量，上皮细胞分解糖原为单糖，乳杆菌将单糖转化为乳酸，维持正常的酸性环境(ph≤4.5，多为3.8～4.4)，抑制其他病原体生长。在机体抵抗力低下、黏膜损伤或内微环境改变时，内的一些常居菌群，如细菌、真菌、螺旋体、支原体等这些菌的毒力增加，造成妇科疾病的爆发。现存技术中，治疗妇科的病的一些品种基本是消杀为主的抗生素产品，在治愈炎症的同时也杀死了保护人体的有益菌群，一旦没有了有益菌群的保护，这时有害菌更加肆意泛滥，更多的妇科疾病随之而来。

  近年来，抑菌凝胶的研究愈来愈普遍，因凝胶材料具备生物粘附性和良好的生物相容性，凝胶可以缓慢地扩散到粘膜，停滞时间较长，有利于彻底杀灭病原体，并且凝胶剂以其独特的润滑性、清凉感及使用起来更便捷等优点而受到患者的青睐。因此，研究疗效好、副作用小的妇科外用抑菌凝胶剂有很重要的现实意义。

  本发明要解决的技术问题为：现有抑制菌类凝胶杀菌能力不强，制备过程繁杂等问题。

  本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法，包括以下步骤：

  准备原材料，按重量份数计，洋甘菊40～70份，当归0.1～0.2份，丹皮0.1～0.4份，水800～1000份，纤维素酶0.3～0.8份，果胶酶0.1～0.4份和芦荟汁60～150份；将洋甘菊、当归丹皮粉碎，加入水中，再加入纤维素酶和果胶酶，在45～55℃下酶解2～6h，冷却至室温，过滤，取上清加入芦荟汁，混匀，消毒，得到发酵原料液；

  取鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌，接种于mrs液体培养基中，在37℃培养箱中培养24h，获得活化的鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌菌种；

  取步骤b活化的两种菌种，分别装入mrs液体培养基中，于37℃恒温培养10～12h后，将培养液在3000rpm离心10min，沉淀用pbs缓冲液分散，得到两种种子液；

  将步骤c所得两种种子液均接入到步骤a所得的发酵原料液中，发酵1～7天，加入壳聚糖沉降5～10h，过滤，上清液灭菌后作为植物发酵液；

  原料组成为：按重量份数计，羟丙基甲基纤维素2～6份、羟乙基纤维素5～30份、甘油10～50份、水苏糖0.1～0.8份，步骤d所得的植物发酵液20～60份，水600份，壳聚糖30～50份，乳酸10～30份，氯化钙溶液200～600份；

  将羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甘油、水苏糖，植物发酵液加入水中，滴入两滴茶树精油，混匀；依次加入壳聚糖、乳酸，搅拌成凝胶状，加入氯化钙溶液，混匀得到抑菌凝胶。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤a所述的纤维素酶酶活≥1万u/g。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤a所述的果胶酶酶活≥50万u/g。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤a所述的原材料为：按重量份数计，洋甘菊45～60份，当归0.1～0.15份，丹皮0.15～0.35份，水800～950份，纤维素酶0.45～0.65份，果胶酶0.2～0.35份和芦荟汁80～120份；酶解温度45～50℃，酶解时间3～5h。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤b所述的鼠李糖乳杆菌购自保藏编号为atcc7469的菌种，所述植物乳杆菌菌种购自保藏编号为atcc8014的菌种。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤d所述鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的接种量各为5～10％，接种浓度各为1.0×106～1.0×108cfu/ml。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤d所述壳聚糖的加入量为溶液总体积的2～10％，优选为5～8％。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤d所述发酵温度为37℃，发酵时间2～4天，沉降时间6～8h。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤e所述氯化钙溶液的浓度为0.5％。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤e所述原料组成为：按重量份数计，羟丙基甲基纤维素3～5份、羟乙基纤维素5～20份、甘油20～40份、水苏糖0.2～0.5份，植物发酵液30～50份，壳聚糖30～45份，乳酸15～28份，氯化钙溶液300～500份。

  进一步的，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤e所述原料中，羟甲基丙基纤维素的粘度为400mpa.s，羟乙基纤维素的粘度为5000mpa.s，水苏糖纯度85％，壳聚糖脱乙酰度为85％～90％。

  本发明提供了一种洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法，采用洋甘菊为原料，通过鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌进行发酵，制备抑菌凝胶，洋甘菊和芦荟可有效修复受损的粘膜，当归和丹皮的添加主要起到止痒和镇痛的效果，两种乳酸菌为了平衡菌群和对抗有害菌的繁殖，甘油主要作为保湿剂，壳聚糖作为主要的凝胶基质，具有非常好的粘附性和生物相容性，延长凝胶的作用时间，更好的发挥疗效。本发明的洋甘菊发酵液抑制菌类凝胶抑菌能力强，安全无副作用，还可以止痒镇痛，修复受损粘膜，有效改善女性妇科炎症。

  准备原材料，按重量份数计，洋甘菊40～70份，当归0.1～0.2份，丹皮0.1～0.4份，水800～1000份，纤维素酶0.3～0.8份，果胶酶0.1～0.4份和芦荟汁60～150份；将洋甘菊、当归丹皮粉碎，加入水中，再加入纤维素酶和果胶酶，在45～55℃下酶解2～6h，冷却至室温，过滤，取上清加入芦荟汁，混匀，消毒，得到发酵原料液；

  取鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌，接种于mrs液体培养基中，在37℃培养箱中培养24h，获得活化的鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌菌种；

  取步骤b活化的两种菌种，分别装入mrs液体培养基中，于37℃恒温培养10～12h后，将培养液在3000rpm离心10min，沉淀用pbs缓冲液分散，得到两种种子液；

  将步骤c所得两种种子液均接入到步骤a所得的发酵原料液中，发酵1～7天，加入壳聚糖沉降5～10h，过滤，上清液灭菌后作为植物发酵液；

  原料组成为：按重量份数计，羟丙基甲基纤维素2～6份、羟乙基纤维素5～30份、甘油10～50份、水苏糖0.1～0.8份，步骤d所得的植物发酵液20～60份，水600份，壳聚糖30～50份，乳酸10～30份，氯化钙溶液200～600份；

  将羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甘油、水苏糖，植物发酵液加入水中，滴入两滴茶树精油，混匀；依次加入壳聚糖、乳酸，搅拌成凝胶状，加入氯化钙溶液，混匀得到抑菌凝胶。

  其中，为越来越好的进行发酵，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤a所述的纤维素酶酶活≥1万u/g。

  其中，为越来越好的进行发酵，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤a所述的果胶酶酶活≥50万u/g。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤a所述的原材料为：按重量份数计，洋甘菊45～60份，当归0.1～0.15份，丹皮0.15～0.35份，水800～950份，纤维素酶0.45～0.65份，果胶酶0.2～0.35份和芦荟汁80～120份；酶解温度45～50℃，酶解时间3～5h。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤b所述的鼠李糖乳杆菌购自保藏编号为atcc7469的菌种，所述植物乳杆菌菌种购自保藏编号为atcc8014的菌种。本发明采用鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌制备抑菌凝胶，鼠李糖乳杆菌是人类肠道分离的有益乳杆菌，能够调节肠道菌群，本发明研究之后发现，将其用作制备妇科抑制菌类凝胶时，其还能够调节的菌群平衡，抑制有害菌的繁殖生长，促进菌群平衡。植物乳杆菌也仅有在人体胃肠道内调节菌群的研究报道，本发明特别的将其用于调节女性菌群上，发现其也能抑制有害菌群繁殖，改善环境，预防妇科疾病产生。

  其中，为了菌群平衡，抑制有害菌的生长繁殖，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤d所述鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的接种量各为5～10％，接种浓度各为1.0×106～1.0×108cfu/ml。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤d所述壳聚糖的加入量为溶液总体积的2～10％，优选为5～8％。本发明采用壳聚糖制备凝胶，具有非常好的粘附性和生物相容性，能够延长凝胶的作用时间，更好的发挥疗效。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤d所述发酵温度为37℃，发酵时间2～4天，沉降时间6～8h。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤e所述氯化钙溶液的浓度为0.5％。

  其中，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤e所述原料组成为：按重量份数计，羟丙基甲基纤维素3～5份、羟乙基纤维素5～20份、甘油20～40份、水苏糖0.2～0.5份，植物发酵液30～50份，壳聚糖30～45份，乳酸15～28份，氯化钙溶液300～500份。

  进一步的，上述洋甘菊发酵液抑菌凝胶的制备方法中，步骤e所述原料中，羟甲基丙基纤维素的粘度为400mpa.s，羟乙基纤维素的粘度为5000mpa.s，水苏糖纯度85％，壳聚糖脱乙酰度为85％～90％。

  下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

  (1)按重量份数比，取洋甘菊45份，当归0.1份，丹皮0.15份，经粉碎处理，加入纯水800份,再加入0.45份的纤维素酶和0.2份的果胶酶，45℃，酶解3h后，降至室温，过滤得上清，即得到植物酶解液，取新鲜芦荟汁80份，混合均匀，巴氏灭菌后至室温得到发酵原料液；

  (3)取2ml步骤(2)中所得的两种活化菌种，分别装入新鲜的mrs液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中培养，得到培养液；将培养液3000rpm离心10min中，离心所得沉淀用无菌pbs缓冲液分散，得到种子液；

  (4)按体积百分比计算，在步骤(1)所得的发酵原料液中接入步骤(3)得到的种子液5％，37℃发酵2天后，加入发酵液体积比的5％的壳聚糖进行沉降6h，将发酵液过滤，得到澄清液，将澄清液巴氏灭菌，冷却后即可得到植物发酵液；

  (5)妇科抑菌凝胶的制备：取羟丙基甲基纤维素3份、羟乙基纤维素10份、甘油20份、水苏糖0.2份，植物发酵液30份，纯水600份，浸泡，待充分溶解后加入0.1μl的茶树精油，混合均匀；

  称取30份壳聚糖加入上述溶液中，均匀搅拌后加入乳酸18份，搅拌后成凝胶状，最后加入0.5％的氯化钙溶液300份，混合均匀即得到妇科抑制菌类凝胶1。

  (1)按重量份数比，取洋甘菊60份，当归0.15份，丹皮0.2份，经粉碎处理，加入纯水920份,再加入0.55份的纤维素酶和0.2份的果胶酶，45℃，酶解3h后，降至室温，过滤得上清，即得到植物酶解液，取新鲜芦荟汁90份，混合均匀，巴氏灭菌后至室温得到发酵原料液；

  (3)取2ml步骤(2)中所得的两种活化菌种，分别装入新鲜的mrs液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中培养，得到培养液；将培养液3000rpm离心10min中，离心所得沉淀用无菌pbs缓冲液分散，得到种子液；

  (4)按体积百分比计算，在步骤(1)所得的发酵原料液中接入步骤(3)得到的种子液10％，37℃发酵3天后，加入发酵液体积比的5％的壳聚糖进行沉降6h，将发酵液过滤，得到澄清液，将澄清液巴氏灭菌，冷却后即可得到植物发酵液；

  (5)妇科抑菌凝胶的制备：取羟丙基甲基纤维素4.5份、羟乙基纤维素15份、甘油20份、水苏糖0.2份，植物发酵液30份，纯水600份，浸泡，待充分溶解后加入0.1μl的茶树精油，混合均匀；

  称取30份壳聚糖加入上述溶液中，均匀搅拌后加入乳酸18份，搅拌后成凝胶状，最后加入0.5％的氯化钙溶液300份，混合均匀即得到妇科抑菌凝胶2。

  (1)按重量份数比，取洋甘菊60份，当归0.15份，丹皮0.3份，经粉碎处理，加入纯水900份,再加入0.6份的纤维素酶和0.3份的果胶酶，45℃，酶解4h后，降至室温，过滤得上清，即得到植物酶解液，取新鲜芦荟汁100份，混合均匀，巴氏灭菌后至室温得到发酵原料液；

  (3)取2ml步骤(2)中所得的两种活化菌种，分别装入新鲜的mrs液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中培养，得到培养液；将培养液3000rpm离心10min中，离心所得沉淀用无菌pbs缓冲液分散，得到种子液；

  (4)按体积百分比计算，在步骤(1)所得的发酵原料液中接入步骤(3)得到的种子液10％，37℃发酵3天后，加入发酵液体积比的5％的壳聚糖进行沉降7h，将发酵液过滤，得到澄清液，将澄清液巴氏灭菌，冷却后即可得到植物发酵液；

  (5)妇科抑菌凝胶的制备：取羟丙基甲基纤维素4份、羟乙基纤维素20份、甘油30份、水苏糖0.2份，植物发酵液30份，纯水600份，浸泡，待充分溶解后加入0.2μl的茶树精油，混合均匀；

  称取40份壳聚糖加入上述溶液中，均匀搅拌后加入乳酸25份，搅拌后成凝胶状，最后加入0.5％的氯化钙溶液400份，混合均匀即得到妇科抑菌凝胶3。

  (1)按重量份数比，取洋甘菊60份，当归0.15份，丹皮0.3份，经粉碎处理，加入纯水900份,再加入0.6份的纤维素酶和0.3份的果胶酶，50℃，酶解4h后，降至室温，过滤得上清，即得到植物酶解液，取新鲜芦荟汁100份，混合均匀，巴氏灭菌后至室温得到发酵原料液；

  (3)取2ml步骤(2)中所得的两种活化菌种，分别装入新鲜的mrs液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中培养，得到培养液；将培养液3000rpm离心10min中，离心所得沉淀用无菌pbs缓冲液分散，得到种子液；

  (4)按体积百分比计算，在步骤(1)所得的发酵原料液中接入步骤(3)得到的种子液10％，37℃发酵4天后，加入发酵液体积比的5％的壳聚糖进行沉降6h，将发酵液过滤，得到澄清液，将澄清液巴氏灭菌，冷却后即可得到植物发酵液；

  (5)妇科抑菌凝胶的制备：取羟丙基甲基纤维素4份、羟乙基纤维素15份、甘油30份、水苏糖0.2份，植物发酵液40份，纯水600份，浸泡，待充分溶解后加入0.2μl的茶树精油，混合均匀；

  称取35份壳聚糖加入上述溶液中，均匀搅拌后加入乳酸25份，搅拌后成凝胶状，最后加入0.5％的氯化钙溶液450份，混合均匀即得到妇科抑制菌类凝胶4。

  抑菌试验主要是采用抑菌圈法测试凝胶对大肠杆菌(8099)、金黄色葡萄球菌(atcc6538)、白色念珠(atcc10231)有没有抑制作用。

  (2)将配制好的琼脂培养基灭菌后在超净工作台中倒入培养板中，每个板中约25ml，凝固待用。取0.5ml菌液加入平板内，涂布器将菌液涂布均匀。

  (3)在培养基表面垂直放入牛津杯，轻轻加压，使其稳固在培养基上。在杯中加入不同体积的抑制菌类凝胶。37℃培养，细菌繁殖体培养24h观察最终结果；白色念珠菌培养48h观察最终结果。抑菌效果如图1所示。

  从图1能够准确的看出，实施例1～4得到的抑制菌类凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都具备比较好的抑菌效果，其中抑菌环的直径≥12mm，符合抑菌要求。

  (1)试验菌株：金黄色葡萄球菌(atcc6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(atcc10231)。0.03mol/l磷酸盐缓冲液(pbs)(ph7.2～7.4)，培养基：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养使用胰酪大豆胨琼脂培养基，白色念珠菌的培养使用沙氏琼脂培养基。

  (2)器材：恒温水浴箱、计时器、超净工作台等。载体为10mm×10mm脱脂白平纹布片，脱脂方法依照《消毒技术规范》(2002版)进行，使用前压力蒸汽灭菌备用。

  (3)操作步骤：取试验菌24h新鲜斜面培养物用pbs洗下，用pbs稀释至约5.0×106cfu/ml～5.0×107cfu/ml制成菌悬液备用。用微量移液器滴染10μl菌悬液于灭菌载体上，36℃±1℃烘干或室温晾干备用。按5g/片的量称取样品于无菌平皿内，置20℃±1℃水浴5min，用无菌镊子取染菌载体，使载体完全浸没于样品中，立即计时。待染菌载体与样品相互作用至说明书的规定时间，分别取染菌载体加入5.0mlpbs试管中，混匀，振荡，将试验菌洗下，分别吸取1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可用pbs进行10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。取同批次pbs、培养基作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在36℃±1℃培养，细菌繁殖体培养48h观察结果；白色念珠菌培养72h观察结果。试验重复3次，计算抑菌率。

  (5)结果判定：抑菌率50％～90％，判有抑菌作用；抑菌率≥90％，判有较强抑菌作用。测试结果表1所示。

  由表1的结果可知，经过实施例得到的凝胶浸泡处理的载体上活菌数较少，甚至在实施例4中，抑菌率达到了100％，表明本发明制备得到的抑制菌类凝胶具有较强的抑菌作用，可有效杀死致病菌，平衡菌落。

  由实施例可知，本发明提供了一种洋甘菊发酵液抑菌凝胶，具有强的抑菌作用，与人体亲和力强，不仅仅可以抑菌，平衡内菌落环境，还可以修复受损伤的黏膜，具有非常好的妇科抑菌作用。本发明的凝胶制备方法简单，原料易得，具有非常好的实用价值。

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